進(jìn)口反相色譜柱是以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。其分離原理是依據(jù)因溶質(zhì)疏水性的不同而產(chǎn)生的溶質(zhì)在流動相與固定相之間分配系數(shù)的差異而分離；適用于大多數(shù)有機(jī)化合物，生物大、小分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸、糖綴合物，樣品一般應(yīng)溶于水相體系中。C18柱為常用的反相色譜柱，因?yàn)橛休^高的碳含量和更好的疏水性，所以對于各種類型的樣品分子結(jié)構(gòu)有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。
與反相色譜柱息息相關(guān)的幾大要素有以下幾個(gè)：
1.柱長
有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加，但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加，它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。
2.溫度
溫度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時(shí)，溫度上升，分子熱運(yùn)動增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
3.流動相組成
流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時(shí)間越短。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性z強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中z常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、4氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。
4.流動相流速
有機(jī)小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。
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