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導(dǎo)論

乳糖操縱子（ lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因，負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)控是分子生物學(xué)中一個(gè)研究較為充分的系統(tǒng)。DNA 結(jié)合蛋白（ lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵因子。該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（  K_D）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。

在這篇應(yīng)用筆記中我們將分享蒙特利爾大學(xué)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來(lái)確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力， K_D）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過(guò)易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來(lái)開(kāi)發(fā) SPR分析，以便在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖 1：乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白結(jié)合

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

系統(tǒng)設(shè)置

圖 2：臺(tái)式 P4SPR 設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過(guò) P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。S形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供三個(gè)重復(fù)樣品的測(cè)量以及與一個(gè)參考通道的控制測(cè)量。通過(guò)透明通道可以直接觀察在通道中是否有氣泡行成，以便立即清除從而防止任何信號(hào)丟失。

圖 3：P4SPR 微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

圖 4：實(shí)驗(yàn)流程圖

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。形成強(qiáng)金-硫鍵后， 當(dāng) SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體進(jìn)行雜交。在結(jié)合測(cè)定之前洗滌傳感器表面。通過(guò)先前儲(chǔ)備的蛋白母液來(lái)制備 5, 20, 50, 100 和 200nM 的蛋白分析物溶液。依次注入逐漸增加濃度的溶液，并用大量洗滌溶液和再生緩沖液孵化 10 分鐘， 用于除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來(lái)自所有 4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 中進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果和討論

在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后，從參考通道信號(hào)中減去來(lái)得到 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間的信號(hào)圖（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來(lái)建立結(jié)合等溫線，從而確定 K_D（圖 6）。計(jì)算的  K_D為 6.4± 1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值¹。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比， SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖 5：關(guān)于不同濃度的 LacO 隨時(shí)間變化的 SPR 信號(hào)

圖 6：疊加 Lacl 濃度增加的結(jié)合曲線

P4SPR 優(yōu)勢(shì)

P4SPR 的模塊式， 便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR工具。它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外， P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)合的親和力。

總結(jié)

P4SPR 成功地檢測(cè)乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可通過(guò)之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。此外， P4SPR 系統(tǒng)也可研究其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA， RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合作用并揭示其在生物系統(tǒng)中的功能。

致謝

我們要感謝 Philipe Lampron， Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 Sébastien Truche 開(kāi)發(fā)該技術(shù)。

關(guān)于 Affinité Instruments

Affinité Instruments 是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究經(jīng)驗(yàn)，并通過(guò)多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR技術(shù)商業(yè)化。

¹Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities ofengineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation.

doi: https://doi.org/10.1101/477893