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近年來，研究人員注意到細胞分選后細胞的變化，如形態(tài)學變化、細胞生長延遲、細胞活力降低以及基因表達的改變。這是因為傳統(tǒng)的細胞分選技術是空氣噴射法，這種分選方式很容易引發(fā)細胞分選后的細胞應激。如何降低或者避免這種分選后細胞應激現(xiàn)象的產(chǎn)生成為細胞分選的一大挑戰(zhàn)。

On-chip Sort 無損傷流式是世界上利用微流控芯片技術進行細胞分選的儀器。這種技術很好的解決了傳統(tǒng)可能出現(xiàn)的細胞損傷和細胞污染等問題。

On-chip Sort 技術的核心是使用一次性的小型微流控芯片，樣品和鞘液分別裝入芯片上的樣品池和鞘液池。傳統(tǒng)的需要特定的鞘液，而On-chip Sort 可以選擇適合細胞的任何鞘液，例如培養(yǎng)基、淡水、海水和油等。

On-chip Sort 無損傷流式通過“流動移位”機制進行，當檢測到目標細胞接近分選區(qū)域時，通過空氣加壓產(chǎn)生短的液體脈沖，將目標細胞轉移到收集池。而非目標細胞則繼續(xù)流動進入廢液池。這種分選的方法不涉及高壓、噴嘴產(chǎn)生靜電和細胞高速碰撞等問題，所以可以實現(xiàn)細胞無損傷分選。

       在進行細胞分析和分選的過程中，所有的液體（包括樣品、鞘液和廢液）都保留在芯片內(nèi)，并不需要外部的儲液裝置。液體流動通道和儲液池中的液體都不會與儀器本身直接接觸，并且芯片也是無菌的，因此不會產(chǎn)生樣本間的污染和樣本與儀器之間的污染。

       基于空氣噴射和反應池混合動力為原理的傳統(tǒng)在進行細胞分選時的多個步驟都很容易對細胞造成破壞或誘導細胞產(chǎn)生應激反應。而On-chip Sort 無損傷流式因為微流控芯片的設計，去除了一些可能會損傷細胞的步驟，并且關鍵還在于其分選壓力比傳統(tǒng)低100多倍，因此可以進行更加溫和的細胞分選，對細胞無損傷。

      On-chip Sort 被用于多種細胞類型的細胞分選，特別是一些非?！按嗳酢钡牟荒苡闷渌鞣诌x的細胞。包括神經(jīng)細胞、iPS衍生細胞、轉染細胞、心肌細胞、肝細胞、精子細胞和脂肪細胞等。接下來，跟大家分享一些利用On-chip Sort 進行細胞分選的結果。

01.  分選對細胞生長的影響

利用On-chip Sort 無損傷流式分選的細胞在分選后第二天開始生長，并且在第三天細胞數(shù)量翻倍增長。另一方面，利用傳統(tǒng)分選的細胞在分選后第三天才開始生長，與On-chip Sort 無損傷流式相比，分選后的細胞生長較慢。

02.  分選對細胞形態(tài)的影響

圖 2 用蘇木精和伊紅染色的外周血嗜酸性粒細胞的形態(tài)學圖。分別利用On-chip Sort 無損傷流式（左）和傳統(tǒng)（右）分選后通過細胞涂片進行固定。

明顯觀察到分選后細胞形態(tài)上的變化。利用On-chip Sort 無損傷流式分選后的嗜酸性粒細胞基本完好無損，細胞結構保持不變。但是，利用傳統(tǒng)分選后的細胞出現(xiàn)破碎的情況。據(jù)推測，傳統(tǒng)的在分選時可能會導致細胞膜受損，所以分選后出現(xiàn)細胞破碎。

03.  分選對基因表達的影響

圖 3 比較利用On-chip Sort 無損傷流式（3a）和傳統(tǒng)A（3b）分選后的HeLa細胞和未分選的HeLa細胞的基因表達水平變化。紅點代表上調基因，綠點代表下調基因。百分比數(shù)字表示所有基因上調（紅色）和下調（綠色）的百分比。（3c）表示通過On-chip Sort 無損傷流式和傳統(tǒng)A分選后Caco-2細胞和HeLa細胞未受影響的基因表達的直方圖。百分比數(shù)字表示所有分類特性（細胞凋亡、細胞黏附、細胞周期等）的未受影響基因占總基因的比例。表達變化的比率被定義為分選細胞的信號強度/未分化細胞的信號強度。
圖 4 具有已確認差異的分類特性的基因表達模式。在每個屬性中，左列和右列分別表示On-chip Sort 無損傷流式和傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)。黑色表示基因表達沒有變化，紅色表示上調，綠色表示下調。

圖3a、3b和3c顯示，與傳統(tǒng)相比，On-chip Sort 無損傷流式對HeLa細胞分選后基因表達變化較小。并且，基因表達水平上沒有變化的基因數(shù)量比傳統(tǒng)高3-5倍。圖4顯示的兩種之間基因表達模式的各種差異支持了圖1表示的兩種對細胞生長速率影響的差異這一結果。盡管基因表達分析是在兩種類型的細胞分選后30到60分鐘內(nèi)完成的，但是根據(jù)分選后的進程不同，結果可能有所不同，總的來說，可以觀察到傳統(tǒng)和On-chip Sort 無損傷流式分選后基因表達的差異。

04.  分選神經(jīng)元

圖 5 散點圖（5a）顯示了利用On-chip Sort 無損傷流式根據(jù)大小從異質DRGs細胞樣本中分選的兩個單獨細胞群（用紅色箭頭表示，命名為“大”和“小”）的閥門。通過抗-β-微管蛋白III（綠色）和抗突觸素（紅色）染色，確定（5a）中分離的“大”（5b）和“小”（5c）細胞群中的神經(jīng)細胞。

從10周齡大鼠收集的DRG細胞通過酶處理分離，并在分選前懸浮在神經(jīng)細胞基礎培養(yǎng)基中。根據(jù)大小對預處理樣品進行分類。從大小分布中觀察到四組細胞，其中兩組細胞利用On-chip Sort 無損傷流式分選并培養(yǎng)五天。這兩個細胞群都被多聚甲醛固定，并用抗-β-微管蛋白III和抗突觸素染色，其中，抗-β-微管蛋白III可以識別神經(jīng)元中的微管蛋白，抗突觸素可以識別負責神經(jīng)傳遞的神經(jīng)元。染色結果證實這兩個細胞群都是DRG中的活性神經(jīng)細胞。因此，這些結果表明，On-chip Sort 無損傷流式能夠按大小分離DRG神經(jīng)元，同時保持細胞活性。

05.  分選誘導性多能干細胞

圖 6 （6a）多步驟負分選原理。紅點是未分化的細胞，藍點是分化的細胞。（6b）通過多步驟負分選從分化的神經(jīng)干細胞樣品中去除未分化的細胞。

On-chip Sort 無損傷流式上的多步驟負分選通過加載樣品（與少有的未分化細胞群混合的分化細胞）到芯片的樣品池中。未分化的細胞（非靶細胞）通過脈沖流的形成而被去除，流入收集池，而分化的細胞（靶細胞）則流入芯片下游的廢液池。分化的細胞被回收并重新加載到樣品池中進行進一步純化。重復這個過程直到所有未分化的細胞被去除。圖6b顯示了含有分化為神經(jīng)干細胞的細胞的樣品中約4%的未分化細胞被去除。用FITC偶聯(lián)的抗-TRA-1-60熒光標記未分化細胞，熒光信號用于檢測。所有未分化的細胞在三次分選后全部被去除，并且分選的分化細胞在培養(yǎng)后表現(xiàn)出良好的細胞活性。

06.  分選細胞-細胞混合物

圖 7 （7a）異質樣品中通過若細胞間相互作用結合在一起的細胞雙復合體（綠色和紅色細胞）的分類。（7b）通過On-chip Sort 無損傷流式分選前（左）和分選后（右）的樣品。